Paleontólogo, arqueólogo e historiador. Nació en Gualeguay, provincia de Entre Ríos, el 22 de agosto de 1865. Fue el iniciador en el país de la exploración arqueológica con criterio estrictamente científico y el primero en realizar estudios sistemáticos del folklore nacional por lo que fue llamado el "Padre de la Ciencia Folklórica". Fue profesor de arqueología americana y director del Museo Etnográfico de la Facultad de Filosofía y Letras de la Universidad de Buenos Aires, que hoy lleva su  nombre y discípulo del gran naturalista Eduardo Holmberg, quien lo impulsó al estudio de las ciencias naturales; bajo la dirección del Profesor Pedro Scalabrini, también se transformó en un destacado zoólogo y paleontólogo, lo que le permitió colaborar con el Museo de Paraná (Entre Ríos) organizando la sección de Paleontología, y en Buenos Aires, donde Ameghino lo designó al frente de la sección Arqueología del Museo de Historia Natural.

En 1906, cuando se desempeñaba como profesor de Arqueología Americana en la Facultad de Filosofía y Letras de la Universidad de Buenos Aires, fundó y organizó integralmente el Museo Etnográfico, aportando su colección personal de más de 20 mil piezas arqueológicas. El Museo Etnográfico fue la primera institución dedicada a esa disciplina en el país. En el marco de las ideas positivistas imperantes, Ambrosetti orientó al Museo en dos direcciones: por un lado, a la investigación y a la formación universitaria superior y, por el otro, a la educación del público en general. La primera causa estuvo corporizada en los trabajos en el noroeste argentino. Para la segunda, constituyó colecciones que debían presentar un panorama universal de las sociedades primitivas. Para esto, Ambrosetti financió viajes e investigaciones, estimuló donaciones y adquirió piezas arqueológicas.

Estudió costumbres y creencias de las culturas precolombinas y halló ciudades prehistóricas como La Paya, en Salta. En 1908 dieron fruto las vastas investigaciones arqueológicas que venía realizando desde tiempo atrás en el noroeste argentino: En Tilcara pudo identificar una antigua población indígena. Desde entonces, en aquel lugar de la Quebrada de Humahuaca, se realizaron excavaciones en forma prolongada y sistemática que aportaron un rico material arqueológico y antropológico, revelador de toda una antigua cultura. Este hecho significó una piedra fundamental para la naciente arqueología nacional.

Es uno de los sabios precursores del estudio del "folklore" argentino. Su libro "Supersticiones y leyendas" constituye un valioso aporte para el conocimiento de la cultura calchaquí. Salvador de Benedetti, ha escrito: "Ambrosetti, en la historia del pensamiento argentino, tendría que aparecer como creador de tendencias de orientaciones nuevas, y como padre de un obra que no ha de perecer, aun cuando le haya tocado actuar en una época, que casi podríamos llamar precursora de la Arqueología Argentina". Siempre sintió atracción por el noroeste argentino, tal Samuel Lafone Quevedo. En su viaje a Tucumán descubrió los famosos "menhires" de Tafí, que describe en uno de sus libros.

En la multifacética obra de Ambrosetti -que comprendió una enorme gama de estudios históricos, etnográficos, lingüísticos, arqueológicos y antropológicos- se incluyen trabajos sobre supersticiones y leyendas, sobre historia, lenguajes indígenas o utilización de metales en la zona de los valles calchaquíes. Fue, como se dijo anteriormente, pionero en el estudio del folklore nacional y en utilizar el término en sentido estricto, es decir, definido como "el conjunto de tradiciones, leyendas, creencias y costumbres de carácter popular, que definen la cultura de una determinada región".

Siendo ya una figura destacada de la ciencia nacional, Ambrosetti fue designado Doctor Honoris Causa por la Universidad de Buenos Aires, en 1910. En aquel momento, ya era reconocido en los ámbitos científicos de América y Europa y había representado al país en numerosos congresos científicos internacionales.

La labor iniciada por Ambrosetti en el Museo y en Tilcara fue asumida, luego de su fallecimiento, por su discípulo Salvador Debenedetti. Ambos son considerados los iniciadores en el país de la ciencia arqueológica (la extensa obra de Ambrosetti quedó documentada en más de setenta publicaciones que constituyen el primer testimonio argentino de esa disciplina).

Entre sus obras se pueden citar: "Los monumentos megalíticos de Tafí del Valle (1896)", "La civilización calchaquí", "Los cementerios prehistóricos del Alto Paraná", etc. Murió en Buenos Aires el 28 de mayo de 1917.